地 龍 為 巨 蚓 科 動(dòng) 物 參 環(huán) 毛 蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）、通 俗 環(huán) 毛 蚓Pheretima vulgaris Chen、 威 廉 環(huán) 毛 蚓Pheretima guillelmi （Michaelsen）或 櫛 盲 環(huán) 毛 蚓Pheretima pectinifera Michaelsen 的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三 種習(xí)稱“滬地龍”。具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利 尿的功效。用于高熱神昏，驚癇抽搐，關(guān)節(jié)痹痛，肢 體麻木，半身不遂，肺熱喘咳，尿少水腫，高血壓等病癥。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

一恒BPH-9082型精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），HH-601 超級(jí)恒溫水浴鍋（鎮(zhèn)江瑞 祥儀器有限公司），MS104 型十萬(wàn)分之一天平、MS1 05DU 萬(wàn)分之一天平（梅特勒 - 托利多國(guó)際貿(mào)易上 海有限公司），KQ2200DV 型超聲振蕩儀（杭州法蘭 特超聲波科技有限公司，DKH-43 型實(shí)驗(yàn)室用膜處 理設(shè)備（上海陶氏膜處理集團(tuán)），LG1100 型蠕動(dòng)泵 （dragonlab 儀器公司），1000Da 納濾膜，3000Da 超濾 膜，燒杯（規(guī)格：10 mL、100 mL、1000 mL、5000 mL）， 量筒（規(guī)格：10 mL、100 mL），培養(yǎng)皿（直徑 10 cm）， 玻璃棒。

1.2 試劑

凝 血 酶（批 號(hào)：20150610，活 力：500 U/g，深 圳 生 化 制 劑 廠）；試 管（0.5 cm×10 cm）；培 養(yǎng) 皿（直 徑 10 cm）；瓊 脂 糖（批 號(hào)：20151102，國(guó) 藥 集 團(tuán) 化 學(xué)試劑有限公司）；牛血纖維蛋白原（純度 95.3%， 批 號(hào)：20140103，購(gòu) 自 沈 陽(yáng) 拜 英 生 物 科 技 有 限 公 司）；牛 血 清 白 蛋 白 BSA（純 度：99.9%，購(gòu) 自 國(guó) 藥 集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；注射用尿激酶（活性：30 萬(wàn) U/g，遼寧天正生物制藥有限公司）；生理鹽水（500 mL，山 東 華 魯 制 藥 集 團(tuán)）；DA201-C、D101、 AB-8 大孔吸附樹脂（購(gòu)自滄州寶恩樹脂有限公司）； sephadex G15、sephadex G25、sephadex G50、Agilent BOZAX300SB-C18肽 色 譜 柱（150 mm，5 μm）、C18 半制備色譜柱（250 mm×50 mm，10 μm），以上色 譜柱購(gòu)自濟(jì)南華哲實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TSK-GEL G2000SWXL 凝 膠 色 譜 柱（300 mm，5 μm，125A）， RP-kromasiloC18色譜柱，以上色譜柱購(gòu)自日本 TSK 公司；分子量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（BSA66430、血管緊張 素 1045.5、低分子肝素鈉 3700、乙酰胺乙酰胺乙酸 189.1）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 纖維平板纖溶實(shí)驗(yàn)試劑配制

磷酸（PBS）緩沖溶液制備：稱取磷 酸氫二鈉和磷酸二氫鈉適量，加入適量去離子水，制 成 pH=7.2 的磷酸緩沖溶液。 工作液：將生理鹽水和配好的 PBS 溶液按照 17∶1 的比例配制工作液。 牛纖維蛋白原溶液：取 0.3 g 牛纖維蛋白原，加 工作液 100 mL 溶液。配制成 0.3% 的牛纖維蛋白原 溶液。 凝血酶溶液：取凝血酶 1.0 g，加生理鹽水制成 10 U/mL 溶液。 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：取工作液 100 mL，采用電熱套 對(duì)其加熱煮沸，加入 0.5 g 瓊脂糖，待其徹底溶解后， 取出、放涼至 50 ℃，加入 20 mL 牛纖維蛋白原溶液， 加入 1.0 mL 10 U/mL 凝血酶溶液，振蕩后導(dǎo)入培 養(yǎng)皿內(nèi)部，每個(gè)培養(yǎng)皿 10 mL，放入 4 ℃冰箱冷藏 15 min。用直徑為 1 mm 打孔器進(jìn)行打孔，并在每個(gè) 孔內(nèi)加入“2.1.1”項(xiàng)下各尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液 10 μL，放 入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h（37 ℃）。取出后采用游標(biāo) 卡尺對(duì)溶圈進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算溶圈面積。以溶圈面積 為縱坐標(biāo)，以尿激酶活力（U）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行 線性回歸，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 1。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：線性方程為 Y=1.564X-1.8635， R2 =0.9972，線性良好。

2.2 多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液

精密稱取牛血清白蛋白 10 mg，加 去離子水溶解，而后轉(zhuǎn)移至 50 mL 容量瓶中定容，備 用。 堿 性 銅 試 液 配 制：精 密 稱 取 烘 干 后 的 NaOH10.0 g、Na2CO3 50 g，加水 400 mL 溶液，備用， 作 為 A 液；再 取 酒 石 酸 鉀 鈉 0.5 g、五 水 硫 酸 銅 0.25 g，加水 80 mL 溶解，作為 B 液。使用時(shí) A 液、B液混合定容至 500 mL 即得堿性銅試液。

福林酚試液配制：取烏酸鈉（Na2WO4·2H2O） 50 g、鉬酸鈉 12.5 g，加水 500 mL 置于 2000 mL 圓底 燒瓶?jī)?nèi)，再加入 35% 磷酸溶液 25 mL、鹽酸（質(zhì)量分 數(shù)為 38.5%）50 mL，然后至于加熱套內(nèi)冷水回流加 熱，沸騰后計(jì)時(shí)，保持微沸 10 h，再加硫酸鋰 25 g、去 離子水 50 mL，搖勻，然后加 0.2 mL 溴，敞口加熱揮 發(fā)多余的溴，保持沸騰 15 min，放涼，倒出，過濾，置 于棕色容量瓶?jī)?nèi)，然后定容至 500 mL，備用。 精 密 量 取 對(duì) 照 品 溶 液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0 mL，分別置具塞試管中，各加水至 1.0 mL，再分 別加入堿性銅試液 1.0 mL，搖勻，各加入福林酚試 液 [ 取福林試液儲(chǔ)備液（1 → 16）]4.0 mL，立即混勻， 置 55 ℃水浴中反應(yīng) 5 min，取出，置冷水浴中冷卻 10 min，照紫外 - 可見分光光度法 (《中華人民共和 國(guó)藥典》2015 年版一部附錄Ⅴ A)，以 0 號(hào)管為空白， 在 650 nm 波長(zhǎng)處迅速測(cè)定吸光度。以吸光度為縱 坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 并計(jì)算線性回歸方程，結(jié)果如圖 2。

3 結(jié)論

采用 DA201-C 樹脂對(duì)地龍酶解液進(jìn)行 吸附工藝考察，通過靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附工藝考 察，得出最佳吸附條件。并進(jìn)行驗(yàn)證得出采用最佳 吸附條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，地龍活性肽吸附率可以達(dá)到 89.65%。 大孔樹脂對(duì)物質(zhì)吸附原理為范德華力，利用 物質(zhì)間極性差異和在不同溶劑的溶解度進(jìn)行分離。 多肽由氨基酸組成，氨基酸由于側(cè)鏈基團(tuán)不同極性 具有差異，因此不同氨基酸組成的多肽之間極性差 異明顯，正是利用此特點(diǎn)本實(shí)驗(yàn)結(jié)合大孔樹脂對(duì)物 質(zhì)的吸附原理結(jié)合多肽特點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為后期多肽類物質(zhì)的純化研究做好基礎(chǔ)。



 

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