老化可使機(jī)體整體內(nèi)環(huán)境發(fā)生巨大改變，也使骨髓內(nèi) 微環(huán)境與復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)、外信號調(diào)控發(fā)生改變。衰老大鼠 的氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致年齡相關(guān)性骨丟失的重要致病機(jī) 制，老化使間充質(zhì)干細(xì)胞更趨向于分化為脂肪細(xì)胞，而 不是成骨細(xì)胞，骨量持續(xù)性減少和丟失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥 發(fā)生。既往研究表明，補(bǔ)腎中藥能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì) 胞成骨分化、提高抗氧化能力抑制成脂分化，但它能否通 過改變細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境起到同樣的作用尚不明確，故本實 驗為此進(jìn)行了研究。

1 材料

金匱腎氣丸、健骨二仙丸、六味地黃丸來源于廣東省 中醫(yī)院藥學(xué)部 ( 金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山萸肉、澤 瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按 8 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 1 ∶ 1 比例組成，健骨二仙丸由龜板、鹿角膠、黨參、枸杞子、 續(xù)斷、山藥按 1 ∶ 1 ∶ 3 ∶ 6 ∶ 6 ∶ 6 比例組成; 六味地黃丸由 熟地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮按 8 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 3 ∶ 3 比例組成) 。清潔級健康 SD 成年大鼠 40 只， 體質(zhì)量 ( 200±50) g，63～ 70 d，雌雄各半，購自廣東省醫(yī) 學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號 SCXK ( 粵) 2013-0002。胎牛血清 ( 貨號 SH30087. 01) 、DMEM-F12 培養(yǎng)基 ( 貨 號 SH30023. 01B ) 、 DMEM-高 糖 培 養(yǎng) 基 ( 貨 號 SH30022. 01B) 、青鏈霉素 ( 貨號 SH30010) 、磷酸鉀緩沖 液 ( 貨號 SH30256. 01B) ( 美國 Hyclone 公司) ; cellTiter 96 AQ 單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑 ( 貨號 G3582，美國 Promega 公司) ; 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基 ( StemPro  Adipogenesis Differentiation Kit，美 國 Gibco 公 司，貨 號 A10070-01) 。潔凈工作臺 ( 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司， 型號 SW-CJ-IFD) ; 低速離心機(jī) ( 安徽中科中佳科學(xué)儀器有 限公司，型號 SC3614) ; 倒置光學(xué)顯微鏡 ( 型號 CKX41、 U-CTＲ30-2，日本 Olympus 公司) ; 上海一恒LHS-100CH恒溫恒濕培養(yǎng)箱; 倒置熒光顯 微鏡 ( 德國 Leica 公司，型號 DMI6000B) 。

2 方法

2. 1 含藥血清制備

金匱腎氣丸、健骨二仙丸、六味地黃 丸濃煎后，分別按照 89. 1、75. 9、85. 8 g /kg 劑量灌胃給 藥，每天 2 次，連續(xù) 7 d，最后 1 d 灌胃給藥后 2 h 再次給 藥。第 2 次給藥后 1 h，大鼠腹主動脈取血，離心，取上 清，除菌，滅活，分裝，－80 ℃ 保存?zhèn)溆?。根?jù)前期實驗篩選出的 10% 含藥血清，將其隨機(jī)分為空白組、模型 組、健骨二仙丸組、六味地黃丸組、金匱腎氣丸組。

2. 2 模型建立及鑒定

10 只大鼠沖出骨髓細(xì)胞培養(yǎng)， 每 3 d 換液 1 次，培養(yǎng) 7 d，300 μmol /L H2O2 處理 24 h。 然后，通過 β-半乳糖苷酶染色鑒定，方法為固定 15 min， 洗滌，染色 12 h，顯微鏡下觀察。

2. 3 細(xì)胞增殖檢測

采用 MTS 法。收集 0、48 h 細(xì)胞，加 入 cellTiter 96 AQ 單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑 4 h 后酶標(biāo)儀讀 板，讀取 490 nm 波長處 OD 值，計算增殖率，公式為增殖 率= ( 48 h 平均 OD 值/0 h 平均 OD 值－1) ×100% ( 同一 樣品) 。

2. 4 成骨誘導(dǎo)、茜素紅染色及 ALP 活性檢測

當(dāng)各組細(xì) 胞貼壁生長達(dá)到 80%融合時成骨誘導(dǎo)，培養(yǎng) 3 d 后再維持 7 d，觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測 ALP 活性，具體檢測步驟按試劑 盒說明書進(jìn)行。繼續(xù)培養(yǎng)至 14 d 后，茜素紅染色鑒定成骨 細(xì)胞。

2. 5 成脂誘導(dǎo)及油紅 O 染色

成脂誘導(dǎo)方法同 “2. 4”項 下成骨誘導(dǎo)。培養(yǎng) 7 d 后，油紅 O 染色鑒定脂肪細(xì)胞。

2. 6 相關(guān)因子檢測

經(jīng)典 TＲIzol 提取總 ＲNA，檢測濃度、 提純、逆轉(zhuǎn)錄，rＲT-qPCＲ 采用一步法，按照說明書進(jìn)行操 作，2－△△Ct 法分析各基因表達(dá)差異。然后，應(yīng)用 Invitrogen 在線 引 物 設(shè) 計 軟 件 OligoPer-fectTM Designer 設(shè) 計，采 用 BLAST 進(jìn)行比對，探針序列由美國 Invitrogen 公司合成，根 據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫序列設(shè)計 ( CollagenΙ ID 100199754，Ｒunx2 ID 12393，DLX5 ID 13395，OSX ID 170574，OCN ID 632， PPAＲγ2 ID 19016，C/EBPβ ID 12608，TAZ ID 66826) ，引 物序列見表 1。

3 結(jié)果

氧化后老化間充質(zhì) 干細(xì)胞在 β-半乳糖苷酶染色陽性率明顯增加，細(xì)胞核周圍 有天藍(lán)色顆粒，補(bǔ)腎中藥處理后陽性率明顯減少，H2O2 處 理后老化間充質(zhì)干細(xì)胞增殖減少，而藥物處理后增加。表 2、圖 1 顯示，與空白組比較，模型組扁平狀、分布稀疏的 老年細(xì)胞數(shù)量明顯增加; 與模型組比較，成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞 均被油紅 O 染為紅色，各補(bǔ)腎中藥組紅染減少，而成骨誘 導(dǎo)后細(xì)胞均被茜素紅染為棕褐色，各補(bǔ)腎中藥組染色增加; 模型組 ALP 活性顯著低于空白組 ( P＜0. 05) ，各補(bǔ)腎中藥 組顯著高于模型組 ( P＜0. 05) 。與 空白 組 比 較，模 型 組 OCN、Collagen Ⅰ、DXL5、OSX、 ＲunX2、TAZ mＲNA 表 達(dá) 顯 著 下 調(diào) ( P ＜ 0. 05) ，PPAＲγ2、 C/EBPβ mＲNA 表達(dá)顯著上調(diào) ( P＜0. 05) ; 與模型組比較， 各補(bǔ)腎中藥組 OCN、DXL5、OSX、ＲunX2、TAZ mＲNA 表達(dá) 顯著上調(diào) ( P＜ 0. 05) ，PPAＲγ2、C/EBPβ mＲNA 表達(dá)顯著 下調(diào) ( P＜0. 05) 。

4 討論

機(jī)體衰老時，內(nèi)環(huán)境氧化應(yīng)激水平增高，抗氧化能力 降低，導(dǎo)致骨質(zhì)量下降，骨皮質(zhì)變薄，骨髓脂肪組織增多， 具有多項分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞特性、增殖活性、端粒 酶活性、端粒長度、分化能力與方向隨之改變，一方面涉 及老化所致的細(xì)胞自身內(nèi)在因素改變，另一方面涉及細(xì)胞 外骨髓內(nèi)微環(huán)境的改變。從細(xì)胞自身來說，Ｒunx2 為特異 性成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而 OSX、Ｒunx2 是多條信號通路的共同下游基因，可作為其 下游基因啟動成骨基因; TAZ 作為共同激活因子，可刺 激 Ｒunx2 轉(zhuǎn)錄而抑制 PPAＲγ2 轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì) 胞向成骨細(xì)胞分化，老化使其水平下調(diào)，干細(xì)胞更趨向與 脂肪分化; ALP 活性正向反映成骨細(xì)胞分化水平，Ⅰ型 膠原是骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要有機(jī)成分，前者表達(dá)取決于后 者產(chǎn)生量; OCN 在成骨晚期的表達(dá)隨著細(xì)胞分化和基質(zhì)礦 化而增加，常作為礦化晚期的標(biāo)志物使用。在骨鈣素、 骨涎蛋白、Ⅰ型膠原的調(diào)控序列上，均存在 Dlx5 的結(jié)合位 點，能促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化，增強(qiáng) Ｒunx2 基因 P1 啟動子的活 性，促進(jìn)成骨分化。PPAＲγ2 正向調(diào)節(jié)脂肪生成，是脂 肪細(xì)胞形成合成通路的中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在分化 早期，C/EBPβ 被活化后表達(dá)增加，隨后激活 C/EBPα，協(xié) 同 PPAＲγ2 共同調(diào)控脂肪分化。本實驗表明，缺少C/EBPβ 的胚胎成纖維細(xì)胞脂肪生成能力明顯減低。



 

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